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病毒核酸檢測(nucleic acid test，NAT)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于血液及其制品的病毒篩查、臨床抗病du藥物治療療效監(jiān)測等。但核酸檢測容易受到檢測樣本的基質(zhì)效應(yīng)和檢測病毒的基因變異等多種因素的影響，使得不同的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用不同的方法學(xué)進(jìn)行核酸檢測的結(jié)果，在量值、靈敏度和特異性方面常出現(xiàn)較大的差異。為使不同實(shí)驗(yàn)室，不同方法間檢測的結(jié)果具有可比性，就必須使檢測標(biāo)準(zhǔn)化， 而標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)是檢測標(biāo)準(zhǔn)化的核心。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的種類

由于血清中病毒核酸的量值不能單獨(dú)應(yīng)用物理和(或)化學(xué)的方法進(jìn)行準(zhǔn)確測定，必須通過一定的核酸擴(kuò)增或雜交過程并經(jīng)相應(yīng)的數(shù)據(jù)處理后才能推測出血清中病毒核酸的原始數(shù)值。所以傳統(tǒng)意義的一級參考測量程序(物理和化學(xué)方法)和一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在核酸檢測中還不存在。病毒核酸檢測標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)目前通常分為國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)、國家或地區(qū)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部的工作制劑等三個(gè)等級。

1.核酸檢測用國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)(reference material)

是指由WHO 多中心研究后由專門委員會(huì)認(rèn)可的，經(jīng)過穩(wěn)定性和組成完整性檢驗(yàn)的，在國際范圍內(nèi)用作有關(guān)量的其他標(biāo)準(zhǔn)定值基礎(chǔ)的物質(zhì)，目前均由英國國家生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和質(zhì)控物研究所(National Institute for Biological Standards and Control，NIBSC)研制并提供。NIBSC于1997年建立了第一代HCVRNA 核酸檢測用國際標(biāo)準(zhǔn)，分別于1999年、2000年、2002年和2003年建立了第一代HIVG1 RNA、HBV DNA、Human parvovirus B19和HAV RNA 核酸檢測用國際標(biāo)準(zhǔn)(表9G1)。核酸檢測用國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)沒有高純度要求，其產(chǎn)量也沒必要滿足常規(guī)實(shí)驗(yàn)室要求，通常制備一批次可供5～10年應(yīng)用。

2.國家或地區(qū)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)

主要面向一個(gè)國家或地區(qū)。在有國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的情況下，可溯源至國際標(biāo)準(zhǔn)，如衛(wèi)生部臨床檢驗(yàn)中心研制的HBV DNA 和HCV RNA 國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。在沒有國際標(biāo)準(zhǔn)的情況下，國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)管理組織可以建立國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)并自行規(guī)定單位，諸如意大利HCV RNA 國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。

3.實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部用的核酸檢測工作制劑

是指相關(guān)診斷試劑生產(chǎn)廠家，在實(shí)際工作中用于校準(zhǔn)或檢查實(shí)物量具、測量儀器或標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的工作標(biāo)準(zhǔn)。如Roche、Chiron 和Bayer等公司自己用的核酸檢測工作標(biāo)準(zhǔn)國家或地區(qū)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和實(shí)驗(yàn)室內(nèi)部的工作制劑等的量值應(yīng)溯源至國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。其測定值的不確定度也應(yīng)大于并包含上一級標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的不確定度。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備

目前，病毒核酸檢測用國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備已經(jīng)程序化，HCV RNA、HIVG1 RNA、HBV DNA、Humanparavo virus B19和HAV RNA的第一代國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，都是按照WHO 的固定程序制備的。

其過程包括原材料的選擇和分裝、穩(wěn)定性和均勻性檢驗(yàn)、多中心合作研究定值、WHO認(rèn)可三個(gè)階段。

下文就原材料的選擇和分裝進(jìn)行介紹。

一、原材料的選擇原則

在選擇用于制備病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的原材料時(shí)，通常應(yīng)該遵循如下基本原則。

1.基質(zhì)相同或相近的原則

核酸檢測用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)所選的原始材料，基質(zhì)應(yīng)和使用的要求相一致或盡可能接近，這樣可以消除方法基質(zhì)效應(yīng)引入的系統(tǒng)誤差。如臨床日常檢測的標(biāo)本使用的是血清(漿)，則相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的基質(zhì)也應(yīng)是血清(漿)；如臨床標(biāo)本的基質(zhì)為細(xì)胞，則標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的基質(zhì)亦應(yīng)為細(xì)胞。目前WHO認(rèn)可的核酸用國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)所選的原始材料，是應(yīng)用混合的陰性血漿[HBGsAg(-)、抗HCV(-)、HCV RNA(-)、HIV 抗原檢測(-)、HIVG1 RNA(-)、HAV RNA(-)和Parvovirus B19(-)]稀釋陽性血漿得到，陽性血漿中含有相應(yīng)經(jīng)過滅活處理的野生型病毒。

2. 原始材料的均勻性原則

由于原始材料可能為多個(gè)來源，因此必須嚴(yán)格混勻以保證材料的均勻性。原始材料可以分成相同的幾份或不同的幾份，一次制備兩批次或多批次的候選國際標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，如NIBSC在制備第一代HCV 核酸檢測用國際標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，除制備了兩批次凍干粉候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)外，還制備了一批次的液體候選標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，這樣可以監(jiān)測制備過程對標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的影響是否相同和選擇國際標(biāo)準(zhǔn)的最佳保存形態(tài)。

3.有代表性及靶病原體含量高的原則

篩選的自然存在的病毒應(yīng)具有代表性，并且目的分析物含量要高。要注意病毒的不同的基因型的分布、病毒核酸常用于核酸擴(kuò)增檢測區(qū)域的保守性，避免使用含有已發(fā)生變異的特殊病毒的原材料。

4.容易大量獲得

易大量獲得，可有效地保證標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的制備原材料有足夠的來源，一次也可大量制備，也可有效地保證成品的均一性。

5.無純度要求

用于病毒核酸制備的原材料可以是純的病原體或培養(yǎng)物，也可以是混雜在臨床標(biāo)本的混合物，只要其基質(zhì)中不含影響檢測的物質(zhì)即可。

6.生物安全性

用于病毒標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備的原材料一般均來自于感染者的標(biāo)本，均具有生物傳染危險(xiǎn)性，因此，在不影響靶核酸的穩(wěn)定性的情況下，應(yīng)盡可能在制備前進(jìn)行滅活處理。理想情況下，是采用無生物傳染危險(xiǎn)性的原材料如體外克隆表達(dá)的病毒樣顆粒來制備。

7.防污染

處理原始材料時(shí)，要注意防止物理、化學(xué)和微生物方面的污染。

8.人工合成的病毒核酸的篩選

選擇人工合成的病毒核酸作為相應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)制備的原材料時(shí)，合成核酸片段序列選擇、長度和理化特性應(yīng)適用于臨床使用的商品試劑盒，特別要注意的是適用于不同的核酸純化方法。其生物安全性、易獲得性、使用的方便程度均應(yīng)明顯好于天然候選物。但裸露的RNA 容易受核糖核酸酶的降解而穩(wěn)定性差。

二、原材料的分裝

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)在液體分裝時(shí)，會(huì)造成分裝體積的不均勻。因此在分裝過程中，每隔一定數(shù)量都會(huì)抽取一分裝單位進(jìn)行稱量，并通過稱量結(jié)果計(jì)算分裝的變異系數(shù)。如NIBSC在制備病毒核酸檢測用HAV RNA、HCV RNA、HIV RNA、HBV DNA和B19 DNA國際標(biāo)準(zhǔn)時(shí)，采用稱重的方法確定分裝的不確定度分別為0.29% 或0.39%、3.2%、0.4%和0.6%、0.63%和0.71%。并在分裝時(shí)盡量避免生物的，化學(xué)的或灰塵污染，操作可以在清潔級的房間內(nèi)操作或在配備高效微粒空氣過濾器的層流柜中操作。分裝應(yīng)盡快在短時(shí)間內(nèi)完成，以確保同一批次所有的分裝單元是在同一時(shí)間同樣條件下分裝。

此外，分裝用分配器、檢測用儀器均應(yīng)進(jìn)行校準(zhǔn)。所有用于制備的玻璃器皿或一次性消耗品均應(yīng)經(jīng)過高壓滅菌消毒。用于制備RNA的玻璃器皿應(yīng)經(jīng)過去核糖核酸酶的處理，一次性消耗品應(yīng)為無脫氧核糖核酸酶和核糖核酸酶的制品。